 |
| Fig 1. Pots d'insulina per pacients. |
L’expressió de
gens de mamífers en bacteris es duu a terme mitjançant la utilització d’enzims
per inserir gens de mamífers en el DNA dels bacteris, aquests gens fan que els
bacteris siguin capaços de sintetitzar un nou producte.
Un exemple seria
la producció de la insulina, la finalitat de la qual, és poder-la subministrar
a pacients que són incapaços de sintetitzar-la
o produir-ne en suficient quantitat (Fig 1).
QUÈ ÉS LA INSULINA
La insulina és
una hormona polipeptídica produïda i secretada pel pàncrees.
En la seva forma
activa consisteix en dos polipèptids (A i B) connectats per ponts disulfurs (Fig 4). A
i B són codificats per parts separades d’un únic gen. Aquest gen codifica per
la preproinsulina, polipèptid llarg que conté un pèptid senyal involucrat en la
excreció de la proteïna, A i B de la molècula activa de la insulina i un
polipèptid que els connecta que no es troba en la insulina madura. La
proinsulina es forma a partir de la preproinsulina i, la conversió de la
proinsulina en insulina es duu a terme per enzims que trenquen la unió del
polipèptid que uneix les cadenes A i B.
 |
| Fig 2. Separació de las cadenes de la insulina. Presentació: El ADN y la ingeniería genética (Tema 13). http://www.slideshare.net/pacozamora1/tema-13-el-adn-y-la-ingeniera-gentica |
L’obtenció de la
insulina humana en bacteris s’aconsegueix produint les cadenes A i B en dos
cultius bacterians separats, ja que, el gen de la insulina està dividit (Fig 2 i 3). Conté un intró que ha de ser suprimit (per splicing) durant el processament del mRNA que dirigeix la síntesi de la proteïna. Els bacteris no ho poden fer, ja que no tenen la maquinària cel·lular necessària per a aquesta eliminació. Posteriorment s’uneixen químicament per produir
la insulina (Dr.
Pedro F. Mateos, 2012). S'utilitzen RNAm perquè no contenen introns i simplifica el procés. Per retrotranscripció d'aquests, s'obté el DNA del que se'n farà la còpia. Per distingir-lo l'anomenarem cDNA. Aquest cDNA serà el que s'inserirà al vector i aquest serà del que se n'obtindran múltiples còpies per a ser utilitzades en la indústria. Cal comprovar de tant en tant que no s'hagin produït mutacions. En el cas que es trobessin canvis en els aminoàcids que modifiquessin la pauta de lectura, aquests es podrien modificar canviant-lo pel que hauria de ser en qüestió per tal d'obtenir la insulina mitjançant una mutagènesis dirigida.
 |
| Fig 3. Producció de la insulina. Presentació: El ADN y la ingeniería genética (Tema 13). http://www.slideshare.net/pacozamora1/tema-13-el-adn-y-la-ingeniera-gentica |
 |
| Fig 4. Formació del polipèptid insulina. Biologia molecular, Christian Neyoy Siar, Instituto tecnológico del Valle de Yaqui. Blogspot.28/02/2013. http://temasbiologiamolecular.blogspot.com.es/2012/05/los-primeros-productos-de-la-ingenieria.html |
ADN
RECOMBINANT O CLONACIÓ CEL·LULAR
És una tècnica
utilitzada en estudis sobre la regulació de l’expressió gènica, en la regulació
de la producció comercial de síntesi de proteïnes com la insulina, en el
desenvolupament d’organismes transgènics i en l’amplificació del DNA (obtenció
d’un gran nombre de còpies d’un gen determinat, mitjançant una tècnica
anomenada PCR).
Consisteix en
introduir el gen seleccionat a l’interior d’un vector i aquest introduir-lo
dins un bacteri on s’expressarà el gen i sintetitzarà la proteïna codificada, a
més les cèl·lules descendents també contindran aquest gen.
Podem
diferenciar les següents etapes:
*OBTENCIÓ DELS RNAm DE LA INSULINA. A partir de cèl·lules pancreàtiques humanes trencades per osmosi o criofracturació, s’extreuen tots els seus enzims, proteïnes, DNA, ... incloent tots els RNAm que codifiquen la síntesi d’insulina humana. Després es separen i aïllen aquests RNAm de la insulina per ultracentrifugació gràcies als seus diferents pesos moleculars i formes característiques. Es realitza una centrifugació per separar els components cel·lulars per mida i densitat i es purifica l’ADN de manera que només queden les cadenes d’insulina. Per purificar la insulina es duu a terme una centrifugació a 4ºC. Finalment, s’obté una solució d’insulina mitjançant el mètode de filtració a pressió “Centricon” que presenta un filtre que permet obtenir partícules d’un pes molecular menor o igual a 3500D. Una sèrie d’aditius presents a la insulina comercial són eliminats, amb l'objectiu d’obtenir una solució d’insulina concentrada, la qual es centrífuga a 3000 rpm fins obtenir-ne un volum reduït, el qual s'emmagatzema en un refrigerador entre 2-8ºC (Tecnología farmacéutica 2008-2009). Els RNAm escollits han de ser els madurs (sense introns).
*OBTENCIÓ DELS RNAm DE LA INSULINA. A partir de cèl·lules pancreàtiques humanes trencades per osmosi o criofracturació, s’extreuen tots els seus enzims, proteïnes, DNA, ... incloent tots els RNAm que codifiquen la síntesi d’insulina humana. Després es separen i aïllen aquests RNAm de la insulina per ultracentrifugació gràcies als seus diferents pesos moleculars i formes característiques. Es realitza una centrifugació per separar els components cel·lulars per mida i densitat i es purifica l’ADN de manera que només queden les cadenes d’insulina. Per purificar la insulina es duu a terme una centrifugació a 4ºC. Finalment, s’obté una solució d’insulina mitjançant el mètode de filtració a pressió “Centricon” que presenta un filtre que permet obtenir partícules d’un pes molecular menor o igual a 3500D. Una sèrie d’aditius presents a la insulina comercial són eliminats, amb l'objectiu d’obtenir una solució d’insulina concentrada, la qual es centrífuga a 3000 rpm fins obtenir-ne un volum reduït, el qual s'emmagatzema en un refrigerador entre 2-8ºC (Tecnología farmacéutica 2008-2009). Els RNAm escollits han de ser els madurs (sense introns).
* OBTENCIÓ
D’UN DNA BICATENARI DE LA INSULINA. A partir de precursors i transcriptases inverses obtingudes de virus
s’obté, d’aquests RNAm, primer un DNA d’insulina monocatenari i després un
bicatenari utilitzant una DNA polimerasa.
*ADICIÓ
O INSERCIÓ DEL DNA DE LA INSULINA EN UN PLASMIDI BACTERIÀ. Els plasmidis són petites molècules de DNA
circular amb una mida menor que el del cromosoma bacterià i que es replica amb
independència ja que tenen el seu propi origen de replicació. Prèviament
es “tallen” els plasmidis utilitzant un tipus d’enzims bacterians coneguts com
enzims de restricció (EcoRI), on cada un reconeixerà una seqüència específica de nucleòtids i
tallaran en aquest punt cada una de les cadenes de DNA. Els extrems lliures que
queden s’anomenen extrems cohesius (escalonats, el tall no es produeix a la
mateixa alçada en les dues cadenes de DNA) (Fig 5), perquè poden unir-se a altres fragments
de DNA que hagin estat tallats pel mateix enzim de restricció.
 |
| Fig 5. Etapes de la producció d’insulina. Nota: “extremos pegajosos” fa referència a extrems cohesius. Biología Molecular, Maria José Villacis. 4 novembre 2012. Blogspot, Universidad Central del Ecuador. 5 març 2013. http://mariajosevillacis.blogspot.com.es/ |
També
s’ha de preparar el DNA de la insulina afegint una seqüència de nucleòtids en
els seus extrems que coincideixen amb els nucleòtids de la zona de tall del
plasmidi. Es tracta després amb el mateix enzim de restricció per obtenir la
molècula de DNA amb el gen de la insulina amb extrems cohesius.A
més de l’origen de replicació, els vectors de clonació (plasmidis) han de
portar altres gens denominats marcadors, que serveixen per identificar les
cèl·lules que contenen el vector de clonació.
Es solen utilitzar com a marcadors, gens de resistència a antibiòtics
que serveixen per identificar bacteris que contenen el vector de clonació,
perquè aquests bacteris seran resistents a l’antibiòtic del gen marcador.
El
següent pas serà introduir el vector de clonació que contingui el gen que es
vol clonar en la cèl·lula hoste, per què aquesta, al multiplicar-se, origini
un clon cel·lular que porti el gen concret. En aquest cas s'utilitza el fenomen
de la transformació, que té lloc espontàniament en certs tipus de bacteris i s'aconsegueix artificialment sotmetent la cèl·lula bacteriana a tractaments
físics i químics: la cèl·lula capta molècules de DNA que es troben en el medi
extern introduint-les en el seu interior i incorporant-les al seu genoma. En
aquest cas s'unirien per transformació els extrems cohesius de DNA de la
insulina amb el DNA del plasmidi tallat. Obtindrem una població de bacteris de
diferents tipus: a) sense plasmidis; b) amb plasmidis; c) amb plasmidis que
contenen el gen de la insulina.
*CERCA I CLONACIÓ DEL BACTERI AMB EL GEN DE LA
INSULINA. Un
cop que s’ha aconseguit la població de bacteris transformats (aquells que
sobreviuran en un medi amb l’antibiòtic corresponent), es posaren els bacteris
en diferents medis de cultiu amb determinats antibiòtics per a què es
multipliquin utilitzant la tècnica rèplica de plaques. Aquesta tècnica
consisteix en posar els bacteris en diferents plaques de cultiu on hi ha,
per exemple, tetraciclina, ampicil·lina (el nostre marcador) o tots dos
junts. Els bacteris amb plasmidis que contenen el gen de la insulina
s’identifiquen perquè produeixen insulina (detectable amb anticossos
radioactius de la mateixa) i perquè a més només creixen en medis amb
ampicil·lina (els bacteris sense plasmidis moren en qualsevol medi amb
antibiòtics i les que tenen plasmidis normals resisteixen als dos tipus
d’antibiòtics). Alhora que es reprodueix el bacteri ho fa també el
plasmidi amb el gen que interessa. El resultat és que s’obtenen clons de
les cèl·lules que porten aquest gen
d’interès i que a més produeixen insulina humana (Biología 2º Bach.
Logse, Instituto de enseñanza secundaria “Isabel de España”) (Fig 6).
 |
| Fig 6. Producció final de la insulina. Presentació: El ADN y la ingeniería genética (Tema 13). http://www.slideshare.net/pacozamora1/tema-13-el-adn-y-la-ingeniera-gentica |
La fabricació d'insulina a nivell industrial s'utilitza en aplicació a la medicina i es duen a terme mitjançant biorreactors i/o tancs de fermentació. La producció d'insulina a escala mundial és de pocs Kg/any.
Finalment, el següent enllaç condueix a un vídeo que pretén ser explicatiu i resumit del procés de la utilització d’un plasmidi com a vector.
CONCLUSIÓ
L’expressió de gens de mamífers en bacteris que es duu a terme mitjançant la utilització d’enzims per inserir gens de mamífers en el DNA dels bacteris , forma part d’una de les tecnologies de la enginyeria genètica amb grans aplicacions d’interès científic i econòmic. Aquestes aplicacions tenen un gran efecte beneficiós per la medicina i per la indústria farmacèutica i la fabricació de gran quantitat de producte. Amb aquesta tècnica aconseguim que la insulina produïda sigui genèticament compatible amb el pacient i no hi hagi problemes que podrien ser produïts per altres animals (i.e.porcs ), ja que aquesta serà pràcticament idèntica a la produïda de manera natural pel nostre organisme i per tant molt útil per aquelles persones que no la poden sintetitzar.
Carla Ibáñez, Eric Quesada, Eva Creus, Montserrat Colomo i Yolanda Lucas
L’expressió de gens de mamífers en bacteris que es duu a terme mitjançant la utilització d’enzims per inserir gens de mamífers en el DNA dels bacteris , forma part d’una de les tecnologies de la enginyeria genètica amb grans aplicacions d’interès científic i econòmic. Aquestes aplicacions tenen un gran efecte beneficiós per la medicina i per la indústria farmacèutica i la fabricació de gran quantitat de producte. Amb aquesta tècnica aconseguim que la insulina produïda sigui genèticament compatible amb el pacient i no hi hagi problemes que podrien ser produïts per altres animals (i.e.porcs ), ja que aquesta serà pràcticament idèntica a la produïda de manera natural pel nostre organisme i per tant molt útil per aquelles persones que no la poden sintetitzar.
Carla Ibáñez, Eric Quesada, Eva Creus, Montserrat Colomo i Yolanda Lucas
REFERÈNCIES BIBLIOGRÀFIQUES
Tema 17: Producción de proteinas terapéuticas. Dr. Pedro F. Mateos. 2012.
Facultad de Biología, Universidad de Salamanca. 2 març 2013. http://darwin.usal.es/profesores/pfmg/sefin/MI/tema17MI.html
Viridiana Rosabelhi Soto Pol et al., Producción de insulina a partir de
organismos bacterianos: Revisión bibliográfica para la técnica molecular.
División académica de Ciencias Biológicas, Universidad Juárez Autónoma de
Tabasco. http://www.publicaciones.ujat.mx/publicaciones/kuxulkab/ediciones/27/05_Producci%C3%B3n%20de%20insulina%20a%20partir%20de%20organismos%20bacterianos.pdf
Viridiana Rosabelhi Soto Pol et al., Producción de insulina a partir de
organismos bacterianos: Revisión bibliográfica para la técnica molecular.
División académica de Ciencias Biológicas, Universidad Juárez Autónoma de
Tabasco. http://www.publicaciones.ujat.mx/publicaciones/kuxulkab/ediciones/27/05_Producci%C3%B3n%20de%20insulina%20a%20partir%20de%20organismos%20bacterianos.pdf
Tecnología farmacéutica G.3. Curso 2008-2009.
http://personal.us.es/mfarevalo/docs/eees-casos/0809/manwani_insilina_oral.pdf
Tecnología farmacéutica G.3. Curso 2008-2009.
http://personal.us.es/mfarevalo/docs/eees-casos/0809/manwani_insilina_oral.pdf
El treball està ben explicat, però li falta algun apartat i cal ampliar-lo en algun aspecte. A l’explicació que feu del que és la insulina s’entén que aquesta està formada pels polipèptids A i B que s’obtenen a partir de cultius bacterians diferents. Caldria explicar per què els dos polipèptids no es poden generar a partir d’un únic procés de clonació del gen de la insulina en bacteris. En el procés de clonació del gen dieu que es parteix de RNA missatger de cèl.lules del pàncrees. Aquesta molècula és molt sensible i té un temps de vida mig molt curt. No tindria més sentit aïllar el gen a partir de DNA (si després també el RNA missatger cal retrotranscriure’l a DNA) i clonar aquest DNA?. Si es fa a partir de RNA missatger heu d’explicar per què. No s'entén bé com s’aïlla el conjunt de molècules de RNA missatgers que codifiquen per la insulina de les que codifiquen per altres gens.
ResponderEliminarSeria interessant que parléssiu de com es produeix la insulina a nivell industrial; expliqueu la tècnica, però no com s’aplica per la producció massiva. Les indústries tenen reactors de 100 litres amb E. coli creixent en fase exponencial?. Quins són els diferents passos de la producció de la insulina a nivell industrial?. Expliqueu que es clona el gen en el bacteri i aquest l’expressa, però llavors com es purifica la proteïna?. Com es separa de la resta de material cel.lular que hi ha al medi?. Això ho podeu explicar i si us falta espai podeu fer servir un gràfic per resumir-ho. Les referències bibliogràfiques cal que estiguin numerades i citades en el cos del text amb la numeració corresponent. Repasseu el format de les citacions de les referències. Cal un apartat de conclusions on comenteu els aspectes més rellevants del treball.
Hola nois! El tema és interessant però tinc una qüestió. Com t'assegures que el plasmidi, al tenir extrems cohesius després de la digestió, no es torni a tancar i el que insereixes a les cèl·lules transformants no sigui un vector sense l'inserit? A més, és estrictament necessari que, quan hem obtingut la insulina, tractar-la amb anticossos radioactius?
ResponderEliminarPodríeu posar algun altre exemple de proteïnes humanes sintetitzades en microorganismes? Si es així s'utilitza el mateix protocol?
Moltes gràcies, Andrea Perez Turu.
Hola Andrea.
ResponderEliminarPer tal que el plasmidi no es tanqui es disposa de mètodes específics. Un d’ells és el tractament amb fosfatasa alcalina amb la que es tracta el vector i s’evita la seva recircularització amb l’eliminació dels dos grups fosfat dels extrems del vector tallat, així no poden formar els enllaços fosfoèsters que els lligaria.
Es tracta amb anticossos radioactius per a reconèixer el vector d’expressió que conté la proteïna. Per a la genoteca és necessària fer-la amb el vector d’expressió, ja que es busca la proteïna resultant de l’expressió i no el gen codificant. També s’utilitza per a mesurar la concentració d’insulina plasmàtica, ja que, disposa de la combinació de dues propietats: per una banda porta anticossos específics, per tant, especificitat i; per altra banda, té una gran capacitat de detecció degut a l’ús d’isòtops radioactius.
Altres proteïnes humanes sintetitzades per microorganismes són factors de coagulació, hormona del creixement, immunomoduladors, etc.
El protocol a seguir és el mateix amb l’aplicació de les variacions adients aplicades al cas particular.
Moltes gràcies!
Eliminar