Secuenciación del genoma bacteriano: usos y aplicaciones
Introducción
La secuenciación es un
proceso que permite determinar el orden en el que se encuentran las bases
nitrogenadas de un DNA. Actualmente, la
secuenciación resulta indispensable en numerosos campos aplicados, que
posteriormente, se expondrán de forma de tallada. A lo largo de la historia se
han desarrollado diferentes métodos para la secuenciación del DNA. El más
utilizado actualmente es el método de Sanger
(1), (2) (Video 1). Los resultados obtenidos mediante este método se
visualizan mediante un secuenciador (Figura 1).
Video 1. Explica de modo esquematizado la realización del método de Sanger.
Figura 1 Se muestra la secuencia de bases de un DNA. Cada color representa un desoxiribonucleótido diferente. La citosina es azul, la guanina negra, la adenina es verde y la timina es roja.
Video 1. Explica de modo esquematizado la realización del método de Sanger.
Figura 1 Se muestra la secuencia de bases de un DNA. Cada color representa un desoxiribonucleótido diferente. La citosina es azul, la guanina negra, la adenina es verde y la timina es roja.
Aplicaciones
Las bacterias presentan
interés desde un punto de vista científico porque tienen una amplia diversidad
y pueden utilizarse en diversos campos (Figura 2).
Figura 2. Resume la cantidad de aplicaciones que tiene la biotecnología a nivel sanitario, agrónomo e industrial.
Aplicaciones taxonómicas
Actualmente, las
bacterias se clasifican por la secuenciación de una parte de su genoma como la
molécula el 16S rRNA (3); aunque todavía se conservan algunas clasificaciones
morfológicas tradicionales debido a que resaltan otras características
importantes de los microoganismos. Las bacterias que pertenecen a un mismo
grupo taxonómico suelen presentar características parecidas, como por ejemplo,
receptores de membrana o actividad metabólica.
Las toxinas de Shiga
(Stx) son una familia de proteínas estructural y funcionalmente relacionadas que
se expresan en Shigella
dysenteriae serotipo 1 y en varios serotipos de Escherichia coli. Mediante la secuenciación genómica se podría saber si se trata de Shigella (Figura 3) o de Escherichia y también mediante su uso de codón (4).
Figura 3. Shigella dysenteriae vista con microscopio electrónico.
Aplicaciones biomédicas
Dentro de este ámbito,
hay muchas aplicaciones, pero principalmente se dividen en dos grandes grupos:
el farmacológico y el preventivo.
Aplicaciones
farmacológicas
La secuenciación del
genoma bacteriano permite la identificación de receptores específicos sensibles
a los fármacos que estén implicados en funciones vitales en las bacterias
patógenas. Esta identificación posibilita el desarrollo de nuevos fármacos más
eficaces. También hay bacterias que secretan sustancias beneficiosas para los
seres humanos, por lo que la secuenciación de éstas, contribuiría a la mejora
de su producción y la identificación de nuevas rutas de producción. Es
importante que estos fármacos afecten a la actividad o al desarrollo de la
bacteria y que no afecten de manera negativa al organismo hospedador.
La aparición de más
bacterias en los hospitales que son resistentes
a antibióticos cada vez es más común. Por eso es importante conocer su
secuencia, para establecer un control sobre estas. Se ha descubierto la cepa
KpO3210 de Klebsiella pneumoniae (5) (Figura 4).
Esta cepa causa enfermedades infecciosas oportunistas y es capaz de sintetizar
carbapenemasa OXA_48 y betalactamasa CTX-M-15; dos enzimas específicas que le
confieren resistencia a todos los antibióticos beta-lactámicos (6), (7). Las
investigaciones se dirigen a encontrar algún gen que le proporcione la
capacidad de ser sensible a los antibióticos beta- lactámicos (Figura 5).
Aplicaciones preventivas
Las aplicaciones
preventivas o vacunas son métodos en los que la secuenciación del genoma
bacteriano, es un factor importante, ya que permite su modificación. Tras la transformación, las
bacterias se introducen en el organismo. Lo que genera una respuesta
inmunitaria que consiste en la generación de anticuerpos específicos para estas
bacterias modificadas potencialmente inactivas.
Actualmente se están
realizando análisis in silico para predecir los antígenos más probables
a ser candidatos vacunales. Para ello,
previamente se ha tenido que hacer la secuenciación del genoma bacteriano. El método se conoce como vacunología inversa
(8) (Figura 6). El primer organismo usado fue Neisseria meningitidis MC58 (Figura 7), una cepa
virulenta del serogrupo B. Se han hallado diferentes proteínas interesantes
como candidatos vacunales. El más destacado es GNA1870 (Genome Derived Antigens). GNA1870 es una proteína
de superficie capaz de inducir inmunidad protectora en animales de
experimentación. Ha sido expresada a altos niveles en el meningococo para producir una vacuna
basada en vesículas de membrana externa, donde este antígeno esté más
representado.
Figura 6. Esquema resume los pasos utilizados en la vacunología inversa.
Figura 7. Nisseria meningitidis visto con microscopio electrónico.
Aplicaciones biotecnología
Respecto a las
aplicaciones biotecnológicas tienen utilidad tanto para el consumo como para el
medio ambiente.
Bioremediación
La bioremediación
consiste en métodos de conservación del medio ambiente, que previamente ha
sufrido daños por efecto de contaminaciones antropológicas o naturales.
Consisten en la potenciación de bacterias que ayudan a reducir o a eliminar
estos efectos. Un buen ejemplo es Pseudomonas stutzer (9) (Figura 8), una
bacteria que ocupa gran diversidad de nichos ecológicos además de tener rutas
metabólicas aeróbicas como anaeróbicas. Es objeto de estudio de cara a
investigar posibles aplicaciones para resolver la contaminación por nitratos
existente en aguas potables, residuales o subterráneas (10).
Figura 8. Colonias de Pseudomonas stutzer en agar.
Figura 8. Colonias de Pseudomonas stutzer en agar.
También se ha conseguido
secuenciar el genoma de Sinorhizobium meliloti GR4 (Figura 9). Esta bacteria se
encuentra en los suelos de Granada y establece una simbiosis mutualista con las
leguminosas. El género Sinorhizobium es capaz de fijar el nitrógeno
atmosférico, favoreciendo que las plantas leguminosas puedan asimilarlo (11).
Otro caso parecido es el de la secuenciación del genoma de Rhizobium etli,
que fija el nitrógeno en la raíz del frijol.
La importancia del descubrimiento se debe a que se podría realizar la
fabricación de biofertilizantes, que son menos tóxicos que los fertilizantes
normales (12). Esto deriva en una mejor calidad de la planta a la hora de su
consumo y además se favorece a la sostenibilidad ambiental.
Figura 9. Sinorhizobium meliloti en la raíz de una leguminosa.
Bioindústria
En este ámbito las
aplicaciones son muy extensas ya que van desde la producción de alimentos hasta
la producción de biopolímeros o biocombustibles que sean viables para el
consumo humano.
En el caso de la
producción de alimentos, las bacterias fermentadoras como Lactobacillus
en la fermentación de lácticos. Es interesante el descubrimiento que se ha hecho
tras la secuenciación de Lactobacilus pentosus (13), en la cepa IG1, que se utiliza en la fermentación de
aceitunas verdes “estilo español” (Figura 10).
Lactobacilus pentosus IG1 tiene la capacidad de adaptarse a los cambios
ambientales. Además presenta genes que le confieren una mejor adhesión al
medio, lo que le confiere una resistencia mayor en condiciones de estrés. Esta
cepa se caracteriza por su alta producción de bactericinas. Todas estas
características hacen que sean buenos probióticos porque mejoran la inmunidad
de la mucosa intestinal y la resistencia contra patógenos (14).
Figura 10. Aceitunas verdes españolas fermentadas por Lactobacillus pentosus.
Se ha descubierto que la
cianobacteria Acaryochloris marina (Figura 11) es capaz de sintetizar clorofila d (Figura 12). La clorofila d absorbe una radiación
en la frontera entre la luz visible (roja) y los rayos infrarrojos. Este hecho
es muy relevante porque no tiene ningún competidor, ni otras bacterias ni
plantas además de tener un genoma muy sofisticado. Se investiga cuál es la
enzima que produce la síntesis de clorofila d, para poder generar
organismos que hiciesen la fotosíntesis
de forma más eficiente (15).
Figura 12. Científico con un matraz, en cuyo interior se encuentra la clorofila d.
Conclusión
Se
espera que con los avances tecnológicos y con ayuda de herramientas
bioinformáticas, se podrán
obtener la secuenciación de forma más eficaz y de una forma más
dirigida. Como por ejemplo, el aparato MinION (16), que permite
secuenciar el genoma de virus y bacterias a una velocidad el 150.000
bases de DNA por hora.
Alba Paramio García
Sufián Laharach
Gerard Romero
REFERENCIAS
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- Rocio María del Rosario, Mensoza María del Carmen. Identificación bacteriana mediante la secuenciación del ARNr 16S: fundamento, metodología y apliaciones en microbiología clínica [Internet]. Universidad de Oviedo. [citado 01/03/13]. Disponible en: http://www.icb.uncu.edu.ar/upload/rodiciocap11.pdf
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BIBLIOGRAFÍA
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- Stanier Roger Y. ...[et al.] Microbiología. 2º ed. Barcelona: Reverté, 1988.
- Luque Cabrera J. Texto ilustrado de biología molecular e ingeniería genética: conceptos, técnicas y aplicaciones para ciencias de la salud. Madrid: Harcourt, 2001.
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ResponderEliminarHola Cristina,
EliminarMuchas gracias por tu pregunta, me parece muy interesante. Ha sido un poco difícil encontrar la información que pedías pero finalmente la hemos encontrado.
Con respecto a tu pregunta del análisis in sílico. En primer lugar, in silico es una expresión que significa hecho por ordenador o mediante simulación computacional. Esto tiene su aplicación en biología para buscar candidatos vacunales para antígenos, estudiar el comportamiento celular o incluso analizar secuencias de DNA.
Para que lo veas de una forma más clara, te voy a poner un ejemplo concreto. Se trata de Programa de EpiQuest-B. El programa de EpiQuest-B es un software que se utiliza para el análisis de la secuencia de una proteína lineal para detectar la presencia de las células B, los epítopos de células T, áreas complejas (inmunológicas, funcionales).
Los epítopos o determinantes antigénicos son cada uno de los sitios discretos de una macromolécula que son reconocidos individualmente por un anticuerpo específico o por un TCR específico. Son las regiones inmunológicamente activas de un inmunógeno (las que se a un receptor de linfocitos o a un Ac libre). Hay epítopos tanto de células B como de células T.
El programa se basa en un algoritmo, que estima la probabilidad de que un péptido particular dentro de la secuencia que se está expuesto en la superficie de la molécula codificada por la secuencia analizada. Es utilizado para la predicción de las regiones más inmunogénicas de la molécula, para definir la capacidad del péptido o fragmento de proteína para provocar una fuerte respuesta humoral o de las células T. También se evalúa la secuencia para su complejidad inmunológica que permite predecir cómo específico para esta molécula en particular será la respuesta inmune.
(PARTE 1)
La necesidad de definir el epítopo potencial dentro de la secuencia por lo general se requiere para:
Eliminar- Para definir la mejor secuencia de péptido con el fin de preparar un anticuerpo específico para una molécula en particular.
- Para encontrar secuencias para la respuesta inmune más probable por el anfitrión (para predecir los sitios para la respuesta autoinmune o respuesta inmune contra un antígeno extraño en particular, tal como el virus de las bacterias con el fin de detectar esta respuesta con fines de diagnóstico)
- Para encontrar las secuencias con más probabilidades de ser blanco de la respuesta de anticuerpos efectiva en el diseño de las vacunas, especialmente los polivalentes donde varias modalidades antigénicos competirán por la atención del sistema inmune del huésped.
Si se va a crear un anticuerpo que reconozca específicamente una molécula en los inmunoensayos, el epítopo ha de ser no sólo inmunogénico (immunodominante), sino que también tiene que ser único para una proteína particular. La mayoría de las veces sus opciones son limitadas, ya que se han de buscar secuencias que no estén ampliamente presentes en otras proteínas.
Además, dicho programa asigna a los péptidos llamados AGI (índice de antigenicidad), de modo que permita elegir el mejor y el más inmunogénico de las especies particulares, como un antígeno para el anticuerpo futuro. La fase actual del programa se basa en la inmunogenicidad de humanos, ratones y conejos.
Lo que es realmente interesante es detectar “epítopos fuertes” capaces de provocar anticuerpos de alta afinidad en la mayoría de los anfitriones. Con el fin de lograr una fuerte respuesta inmune en el antígeno deseado (es decir, cuando la preparación de suero es hiperinmune específica), son de importancia crítica varios pasos en la cascada de la respuesta humoral:
1. La entrega eficaz de antígeno a dendríticas / célula presentadora de antígeno.
2. El procesamiento eficaz del antígeno por las células dendríticas y la presentación de antígenos.
3. La fuerte estimulación de células T auxiliares.
4. Una presentación eficaz del antígeno por las células dendríticas a las células B. Esto conduce a la producción de anticuerpos de alta afinidad.
(PARTE 2)
Sin embargo, no todos los antígenos tienen las propiedades requeridas para su procesamiento óptimo, la presentación y la respuesta inmune efectiva, por lo tanto, se utilizan diferentes adyuvantes para impulsar la producción de anticuerpos. La mayoría de ellos ayudan a la formación de un depósito del antígeno, y sólo algunos están implicados en la estimulación de la respuesta inmune. Por ejemplo, el ayudante MAD aumenta la concentración de anticuerpos específicos en suero 4-30 veces.
EliminarMAD se compone de pequeños dendrímeros (<10 kD) de carga positiva en su superficie. Un número de péptidos, epítopos auxiliares y estimuladores de la proliferación de células T cooperadoras están unidos covalentemente a algunos de estos dendrímeros. Cuando el antígeno se mezcla con MAD, se obtiene la molécula de complejo grande, cargado positivamente, que se une efectivamente a receptores de antígenos en las células dendríticas, y estimula eficazmente la actividad de células T cooperadoras, induciendo de este modo fuerte y la respuesta inmune específica.
Así que los candidatos vacunales han de cumplir estas características, es decir, que provoquen una alta respuesta inmunitaria por parte del organismo al que se le suministra la vacuna.
Espero que te haya servido de ayuda.
(PARTE 3)
Comentari avaluable:
ResponderEliminarLa seqüenciació del genoma es pot realitzar a tot tipus de bacteris?
Les aplicacions preventives o vacunes poden causar efectes negatius a les persones o animals als quals se'ls hi subministra?
Moltes gràcies.
Hola Marta,
EliminarMuchas gracias por tu comentario. Respondiendo a tu primera pregunta, el término "todos los tipos de bacterias", se debería coger con pinzas. Como hemos visto en clase, la diversidad de bacterias es muy amplia y a día de hoy sólo se conoce una pequeña parte. Un ejemplo de ello es la "gran anomalía del recuento en placa". Este fenómeno consiste en que al recoger, por ejemplo, muestras de boca, oídos o de la piel; se observa una cantidad ingente de microorganismos. Sin embargo, a lo hora de cultivarlos en el laboratorio, solamente se consigue observar una minúscula minoría de estos. De este modo, no se puede realizar la secuenciación de todos los microorganimos, como preguntabas tú. Sería posible realizar la secuenciación una vez que se obtiene en el laboratorio un cepa pura. Esto es difícil de conseguir porque los procariotas tienen una cultivabilidad menor al 1%. Para realizar una secuenciación de todas las bacterias se tendrían que mejorar los protocolos y las técnicas para el cultivo de estos. La ventaja que ofrece la secuenciación del genoma bacteriano es que permite clasificar a las bacterias filogenéticamente desde familia hasta cepa.
Con respecto a la segunda pregunta. En primer lugar, hay que aclarar un concepto. Lo que se hace en el laboratorio para obtener los candidatos vacunales, es utilizar protocolos por los cuales se puedan mejorar la respuesta inmunológica. Pero a la hora de suministrar la vacuna al paciente, es como si fuese una vacuna normal y corriente. Obviamente, los métodos que se utilizan en el laboratorio no son infalibles y siempre se tratan de mejorarlos, por lo que sí pueden aparecer efectos adversos tras la vacunación.
La mayoría de los efectos adversos producidos por la vacunación son leves y transitorios. La causa de los efectos adversos puede ser debido a la propia vacuna, a los conservantes que se añaden para mantenerla estable, los antibióticos que se añaden en ocasiones para evitar su contaminación o a otras sustancias presentes en algunas vacunas.
Los efectos adversos más graves (reacciones anafilácticas o encefalopatía) son muy poco frecuentes (aproximadamente 1 caso de cada millón de vacunas puestas) y mucho menos frecuentes que los producidos por la propia enfermedad contra la que se protege.
Los efectos adversos más habituales son:
Dolor, hinchazón y/o enrojecimiento en el lugar de la punción Es una reacción relativamente frecuente y pasajera.
Aparición de un pequeño bulto duro en el lugar de la punción. Ocurre sobre todo tras la vacunación frente a la Tos ferina.
Fiebre. Casi cualquier preparado vacunal puede producir fiebre después de su administración aunque la introducción de las nuevas vacunas frente a la Tos ferina (DTPa) ha hecho que esta reacción sea menos frecuente.
A pesar de todo eso, las vacunas en la actualidad son muy seguras y el número de efectos secundarios de importancia es muy pequeño y si lo comparamos con el beneficio que producen, se podría decir que este riesgo es desdeñable.
Espero que te haya servido la información.
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ResponderEliminarPregunta evaluable:
ResponderEliminarEn la secuenciación de DNA de procariotas, se menciona que una de sus aplicaciones es la taxonomía ¿el RNA ribosómico 16S es el único que se secuencia con este fin? ¿Por que no se utiliza DNA nuclear?
Muchas gracias
Marina Gutiérrez Pulpeiro (GM6)
En procariotas principalmente se utiliza el RNA ribosómico 16S para las aplicaciones taxonómicas mediante la seqüenciacion, ya que es un gen localizado en todos procariotas. La función de dicho gen no ha cambiado con el tiempo, lo que sugiere que los cambios generados al azar en la secuencia, ayudan a determinar el tiempo en el que han evolucionado las bacterias.Además es lo suficientemente grande(1500pb)como para trabajar informáticamente con él.
EliminarTambién se puede usar el 23S. En el caso de los eucariotas se utiliza principalmente el 18S.
No se utiliza el DNA nuclear porque los procariotas no tienen núcleo,por lo tanto, no tiene ADN nuclear. Puede que te estés refiriendo a DNA genómico. En este caso, como he comentado anteriormente, el RNA riboómico 16S es más conservado que el DNA.
Pregunta evaluable:
ResponderEliminarEn el caso de las infecciones nosocomiales ¿Todas las investigaciones que se llevan a cabo, tienen como objetivo encontrar los citados receptores relacionados con el metabolismo celular, o se buscan/hay otros métodos génicos para eliminar al microorganismo?
Gracias.
Juan José Rivero Cazorla (GM6)
Las investigaciones que se llevan acabo tienen como objetivo principal encontrar los receptores relacionados con las vías metabólicas, ya que una inactivación estos receptores metabólicos pueden provocar una inhibición funcional o vital del microorganismo.
EliminarPor supuesto, hay otros métodos génicos que permiten la inhibición funcional o vital del microorganismo, como por ejemplo la inhibición de la síntesis de proteínas estructurales (pared celular, membranas…) o inhibición de proteínas esenciales para el funcionamiento.
Pregunta avaluable:
ResponderEliminarEn relació als biofertilitzants poden substituir completament els fertilitzants químics, o bé tenen limitacions? A partir de la seqüenciació del genoma Rhizobium etli es podria incrementar el rendiment de la proteïna encarregada de la fixació del nitrogen?
Gràcies,
Anna Garcia Olmos
Pregunta evaluable:
ResponderEliminarSi las bacterias modificadas de las vacunas están inactivas y el huesped no sufre ningún tipo de daño, ¿cómo se activa el sistema inmune?
Mª del Camino García